Approach to   protein barriers   : emerging mechanisms of replication that pause in eukaryotes

During nuclear DNA replication, multiprotein replisome machines must jointly traverse and duplicate the entire length of each chromosome during each cell cycle. At certain  genomic locations, replisomes  encounter tight DNA-protein complexes and slow down. This fork pausing is an active process that involves the detection of a protein barrier by the approaching replisome   via   an evolutionarily conserved fork pausing / safety complex (FPC).

The action of the  FPC protects forks from breakdown at both  programmed and random protein barriers, thus promoting genome integrity. In addition, FPC stimulates the DNA replication checkpoint and regulates topological transitions near the replication fork. It has been suggested  that  eukaryotic cells use  physiologically programmed fork pauses for various purposes, such as maintaining copy number at repetitive loci, preventing replication-transcription encounters, regulating kinetochore assembly, or controlling gene conversion events during the transition from Mating type.

Hier besprechen wir die wachsende Zahl von Ansätzen, die verwendet werden, um die Replikationspause  in vivo  und  in vitro  zu untersuchen, sowie die Charakterisierung zusätzlicher Faktoren, von denen kürzlich berichtet wurde, dass sie die Fork-Pausierung in verschiedenen Systemen modulieren. Insbesondere konzentrieren wir uns auf die optimistic Rolle von Topoisomerasen beim Pausieren von Gabeln. Wir beschreiben ein Modell, bei dem die Replisomenprogression von Natur aus vorsichtig ist, das die allgemeine Erhaltung der Fork-Stabilität und Genomintegrität sicherstellt, aber auch an bestimmten Loci spezialisierte Funktionen ausführen kann. Darüber hinaus beleuchten wir klassische und neuartige offene Fragen des Feldes und schlagen Orte vor, um diese zu bearbeiten. Angesichts des geringen Wissens über das Anhalten von Replisomen an Proteinbarrieren in menschlichen Zellen sind weitere Studien erforderlich, um zu untersuchen, wie konserviert diese Mechanismen sind.

Neutronen-Spin-Echo-Spektroskopie als einzigartige Sonde für Lipidmembrandynamik und Membran- Protein-  Wechselwirkungen

Lipid-Doppelschichten bilden die Hauptmatrix der Zellmembranen und sind neben anderen lebenswichtigen zellulären Prozessen die primäre Plattform für den Nährstoffaustausch, Protein-Membran-Wechselwirkungen und die virale Knospung. Für eine effiziente biologische Aktivität sollten Zellmembranen steif genug sein, um die Integrität der Zelle und ihrer Kompartimente aufrechtzuerhalten, aber dennoch flüssig genug, um Membrankomponenten, wie Proteine ​​und funktionelle Domänen, zu diffundieren und zu interagieren.

Dieses empfindliche Gleichgewicht der elastischen und flüssigen Membraneigenschaften und deren Einfluss auf die biologische Funktion erfordern ein besseres Verständnis der kollektiven Membrandynamik über mesoskopische Längen- und Zeitskalen wichtiger biologischer Prozesse, zB Membrandeformationen und Proteinbindungsereignisse. Zu den Techniken, die diesen dynamischen Bereich effektiv untersuchen können, gehört die Neutronen-Spin-Echo-(NSE)-Spektroskopie.

In Kombination mit der Deuteriummarkierung kann NSE verwendet werden, um direkt auf Biegungs- und Dickenschwankungen sowie auf die mesoskopische Dynamik ausgewählter Membranmerkmale zuzugreifen. Dieses Papier bietet eine kurze Beschreibung der NSE-Technik und skizziert die Verfahren zur Durchführung von NSE-Experimenten an liposomalen Membranen, einschließlich Particulars zur Probenvorbereitung und Deuterierungsschemata, zusammen mit Anweisungen zur Datensammlung und -reduktion.

Das Papier stellt auch Datenanalysemethoden vor, die verwendet werden, um wichtige Membranparameter wie den Biegesteifigkeitsmodul, den Flächenkompressibilitätsmodul und die In-Airplane-Viskosität zu extrahieren . Um die biologische Bedeutung von NSE-Studien zu veranschaulichen , werden ausgewählte Beispiele von durch NSE untersuchten Membranphänomenen diskutiert, nämlich der Einfluss von Additiven auf die Biegesteifigkeit der Membran, der Einfluss der Domänenbildung auf Membranfluktuationen und die dynamische Signatur von Membran-Protein-Wechselwirkungen

Verständnis einzelner SARS-CoV-2-  Proteine  für die gezielte Medikamentenentwicklung gegen COVID-19

• SARS-CoV-2 verursacht die COVID-19-Pandemie, die weltweit für Millionen von Todesfällen verantwortlich ist. Selbst mit wirksamen Impfstoffen wird sich das SARS-CoV-2-Virus wahrscheinlich durch Lücken in der Wirksamkeit und Impfung sowie durch das Auftreten neuer Stämme in der menschlichen Bevölkerung behaupten . Daher ist es für die Bekämpfung dieses Virus und die Vorbereitung auf zukünftige Ausbrüche von entscheidender Bedeutung zu verstehen, wie SARS-Cov-2 solch weit verbreitete Gewebeschäden verursacht, und die Entwicklung gezielter pharmakologischer Behandlungen.
• Hier fassen wir die bisherigen Fortschritte  bei der Untersuchung einzelner SARS-CoV-2-Proteine ​​und ihrer pathogenen Mechanismen mithilfe von  In-vitro- oder  In-vivo- Modellen zusammen . Wir haben die SARS-CoV-2-Proteine ​​in drei Kategorien eingeteilt: Wirtseintritt, selbsttätig und Wirtsinteraktion. Dieser Assessment konzentriert sich auf die selbsttätigen und mit dem Wirt interagierenden SARS-CoV-2-Proteine ​​und fasst den aktuellen Wissensstand darüber zusammen, wie diese Proteine ​​die Virusreplikation fördern und Wirtssysteme stören, sowie auf Medikamente, die auf diese Virus- und interagierenden Wirtsproteine abzielen .
• Viele dieser Medikamente befinden sich derzeit in klinischen Studien zur Behandlung von COVID-19. Zukünftige Coronavirus-Ausbrüche werden höchstwahrscheinlich durch neue Virusstämme verursacht, die den Impfstoffen durch Mutationen in Wirtseintrittsproteinen entgehen. Daher ist die Untersuchung individueller selbsttätiger und mit dem Wirt interagierender SARS-CoV-2-Proteine ​​für gezielte therapeutische Interventionen nicht nur für die Bekämpfung von COVID-19 unerlässlich, sondern auch wertvoll gegen zukünftige Coronavirus-Ausbrüche.

Der Bau eines Tremendous Ordner Fluorescent  Protein -Geführte sekretorische Expression System für die Produktion von Phospholipase D in  Bacillus subtilis

Phospholipide (PLs) sind einer der Hauptbestandteile in Lebensmitteln und Nutrazeutika, Kosmetika, Landwirtschaft und pharmazeutischen Produkten. Phospholipase D (PLD) ist ein entscheidendes Enzym für die biokatalytische Synthese oder Modifikation von PLs. Hier haben wir zur effizienteren Herstellung von PLD ein PLD-Expressions- und Sekretionssystem in Bacillus subtilis konstruiert   und ein umweltfreundliches Reaktionssystem entwickelt.

Ein nichtklassischer sekretorischer Weg, bei dem ein grün fluoreszierendes Superfolder-Protein als N-terminales Leitprotein fungiert, wurde eingeführt. Dieses Expressionssystem kann nicht nur ein schnelles Screening von hochgradigen Expressionsstämmen erreichen, sondern kann auch die Sekretion der Zielproteine ​​erreichen. Unter optimalen Fermentationsbedingungen betrug die Enzymaktivität des Kulturmediums 0,35 U/ml, was dem 2,05-fachen der der Sec-Sekretionsweg-Stämme entsprach.

Inzwischen wurden die Wirkungen mehrerer organischer Lösungsmittel in den zweiphasigen Reaktionsmedien verglichen. Die Ergebnisse zeigten, dass bei Verwendung von Cyclopentylmethylether als organische Part die Endumwandlungsrate 96,9 % erreichte. Es hat ein gutes Anwendungspotenzial bei der Synthese von Phosphatidylserin gezeigt, den Grundstein für die Synthese und Anwendung anderer seltener und hochwertiger PLs gelegt und eine Referenz für die Herstellung anderer Biokatalysatoren bereitgestellt.

Die  Expression des Immuncheckpoint B7-H3-  Proteins ist mit einem schlechten Consequence und einem Androgenrezeptorstatus bei Prostatakrebs verbunden

Hintergrund:  Neue Immun-Checkpoint-basierte Immuntherapien können bestimmten Gruppen von Prostatakrebspatienten zugute kommen, die gegen andere Behandlungen resistent sind.

Methoden:  Wir analysierten immunhistochemisch die Expression von B7-H3, PD-L1/B7-H1 und Androgenrezeptor (AR) in Gewebeproben von 120 Prostatakarzinompatienten, die in Spanien mit radikaler Prostatektomie behandelt wurden, und von 206 Prostataadenokarzinompatienten, die mit Radikale Prostatektomie in Norwegen.

Ergebnisse: Die  B7-H3-Expression korrelierte positiv mit der AR-Expression und battle mit einem biochemischen Rezidiv in der spanischen Kohorte assoziiert, aber die PD-L1-Expression korrelierte mit keinem von beiden. Die Ergebnisse für B7-H3 wurden in der norwegischen Kohorte validiert , wo die B7-H3-Expression positiv mit dem Gleason-Grad, den Operationsrändern, der Samenbläscheninvasion und der CAPRA-S-Risikogruppe korrelierte und mit einem klinischen Rezidiv assoziiert battle. Eine hohe B7-H3-Expression in der norwegischen Kohorte stimmte auch mit einer positiven AR-Expression überein.

Schlussfolgerung:  Diese Ergebnisse legen eine deutliche klinische Relevanz der beiden Immuncheckpoint-Proteine ​​PD-L1 und B7-H3 bei Prostatakrebs nahe. Unsere Ergebnisse heben B7-H3 als umsetzbares neues Immun-Checkpoint-Protein bei Prostatakrebs hervor.

Funktionelle Einblicke in die hochmolekularen Penicillin-bindenden  Proteine  von  Streptococcus agalactiae  durch Gendeletions- und Transposon-Mutagenese-AnalyseTRANSLATE

Hochmolekulare Penicillin-bindende Proteine ​​(PBPs) sind Enzyme, die die Biosynthese des bakteriellen Zellwandpeptidoglycans katalysieren. Die Gram-positive Bakterien – Pathogen  Streptococcus agalactiae  (Gruppe B  Streptococcus oder GBS) erzeugt fünf hochmolekulare PBPs, nämlich PBP1a, PBP1b, PBP2a, PBP2B und PBP2x. Von diesen ist nur PBP2X für die Lebensfähigkeit der Zellen essentiell , während die anderen vier PBPs einzeln entbehrlich sind. Die biologische Funktion der vier nicht-essentiellen PBPs ist bei GBS schlecht charakterisiert. Wir haben  pbp1a ,  pbp1b ,  pbp2a und  pbp2b . gelöscht Gene einzeln aus einem genetisch intestine charakterisierten Serotyp-V-GBS-Stamm und untersuchten die Phänotypen der vier isogenen Mutantenstämme. Im Vergleich zum Wildtyp-Elternstamm (i) hatte keiner der  isogenen pbp-  Mutantenstämme einen signifikanten Wachstumsdefekt in THY-reichem Medium, (ii) die isogenen Mutantenstämme Δ pbp1a  und Δ pbp1b  hatten eine signifikant erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Penicillin und Ampicillin und iii) isogene Mutantenstämme pbp1a  und Δ pbp2b  hatten signifikant längere Kettenlängen.

Unter Verwendung gesättigter Transposon-Mutagenese und Transposon-Insertion-Website-Sequenzierung haben wir Gene bestimmt, die für die Lebensfähigkeit des Wildtyp-GBS-Stammes und jedes der vier isogenen pbp-  Deletionsmutanten-Stämme in THY-reichem Medium essentiell sind  . Das  pbp1a-  Gen ist für die Lebensfähigkeit der Zellen im  pbp2b-  Deletionshintergrund essentiell . Reziprok,  pbp2b  ist wichtig , in der  PBP1a  Löschung Hintergrund. Darüber hinaus ist das Gen, das RodA kodiert, eine Peptidoglycan-Polymerase, die in Verbindung mit PBP2B arbeitet, auch im  Hintergrund der pbp1a- Deletion essentiell  . Zusammengenommen legen unsere Ergebnisse eine funktionelle Überlappung zwischen PBP1A und PBP2B-RodA-Komplex in der GBS-Zellwand-Peptidoglycan-Biosynthese nahe.

IMPORTANT    Excessive Molecular  Weight Penicillin Binding Proteins (HMM-PBPs)  are enzymes required for bacterial cell wall biosynthesis. Group B streptococci   (GBS) micro organism   produce 5 totally different HMM-PBPs. The organic features of those proteins are usually not properly characterised in GBS. On this examine, we carried out a complete deletion evaluation of genes encoding HMM-PBPs in GBS. We discovered that deleting sure PBP-encoding genes altered bacterial susceptibility to beta-lactam antibiotics, cell morphology, and the essence of different   enzymes concerned in cell wall peptidoglycan synthesis  . The results of our study shed new light on the biological functions of PBPs in GBS.