SPC1 reguliert die Signal – Peptidase-vermittelte Verarbeitung von Membranproteinen

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Interleukin 10 spielt eine wichtige Rolle bei neugeborenen Ratten mit hypoxischer Ischämie im Zusammenhang mit B-Zell-Lymphom 2 und endoplasmatischem Retikulum-  Protein  29

 

Interleukin 10 (IL-10) ist ein synthetischer Inhibitor menschlicher Zytokine mit immunmodulatorischer und entzündungshemmender Wirkung. Diese Studie wurde entwickelt, um die Expressionsvariation von IL-10 an den verschiedenen Stellen, einschließlich Kortex, Hippocampus und Lungengewebe neonataler hypoxisch-ischämischer (HI) Ratten zu untersuchen und die entscheidende Rolle von IL-10 bei der Linderung von HI-Hirnschäden zu untersuchen. In dieser Studie wurden neugeborene Sprague-Dawley-Ratten einer Ligatur der rechten Halsschlagader, gefolgt von 2 h Hypoxie, unterzogen.

Die Expression von IL-10 im Kortex, Hippocampus und Lungengewebe wurde mit Immunhistochemie, quantitativer Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) und Western Blot (WB) gemessen. Immunfluoreszenz-Doppelfärbung wurde durchgeführt, um die Lokalisierung von IL-10 in Neuronen und Astrozyten zu beobachten. Darüber hinaus wurden den Ratten der Negativkontrolle (NC) bzw. der IL-10-Gruppe IL-10-siRNA-Lentivirus-Vektoren ohne Targeting und Targeting injiziert, und die mRNA-Spiegel von B-Zell-Lymphom 2 (Bcl-2) und endoplasmatischen reticulum Protein 29 (ERp29) wurden durch RT-qPCR nach IL-10 Stille nachgewiesen.

Die Ergebnisse zeigten, dass die IL-10-Expression deutlich erhöht war, nachdem HI und IL-10 mit Neuronen und Astrozyten kolokalisiert wurden, die durch HI-Insult schwer verletzt wurden. Darüber hinaus waren Bcl-2 und ERp29 nach IL-10-mRNA-Interferenz im Vergleich zur NC-Gruppe bemerkenswert verringert. Unsere Ergebnisse zeigten, dass IL-10 seine antiapoptotischen und neuroprotektiven Wirkungen durch die Regulierung der Expression von Bcl-2 und ERp29 ausübte, was darauf hindeutet, dass IL-10 ein vielversprechendes Zielmolekül für die HIE-Behandlung sein könnte.

SPC1 reguliert die Signal – Peptidase-vermittelte Verarbeitung von Membranproteinen

Signalpeptidase (SPase) spaltet die Signalsequenzen (SSs) von sekretorischen Vorläufern. Es enthält eine evolutionär konservierte Untereinheit des Membranproteins, Spc1, die für die katalytische Aktivität der SPase entbehrlich ist, und ihre Rolle bleibt unbekannt. In der vorliegenden Studie haben wir die Funktion von Hefe-Spc1 untersucht. Zuerst haben wir einen In-vivo-SPase-Spaltungsassay mit sekretorischen Protein-CPY- Varianten mit SSs in den n- und h-Regionen modifiziert.

Beim Vergleich der SS-Spaltungseffizienzen dieser Varianten in Zellen mit oder ohne Spc1 fanden wir, dass signalverankerte Sequenzen anfälliger für die Spaltung durch SPase ohne Spc1 wurden. Darüber hinaus wurde die SPase-vermittelte Prozessierung von Modellmembranproteinen in Abwesenheit von Spc1 verbessert, jedoch bei Überexpression reduziert. Spc1 wurde zusammen mit Proteinen immunpräzipitiert, die ungespaltene signalverankerte oder Transmembran(TM)-Segmente trugen.

Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass Spc1 TM-Segmente vor der SPase-Wirkung schützt, wodurch die Substratselektion für SPase geschärft wird und als negativer Regulator für die SPase-vermittelte Prozessierung von Membranproteinen agiert .

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Multiplex- und markierungsfreier Hochdurchsatznachweis von RNA/Spike-  Protein /IgG/IgM-Biomarkern der SARS-CoV-2-Infektion unter Verwendung nanoplasmonischer Biosensoren

Um den COVID-19-Ausbruch zu bekämpfen, der durch das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) verursacht wird, besteht ein ungedeckter Bedarf an hochpräzisen diagnostischen Tests in allen Stadien der Infektion mit schnellen Ergebnissen und hoher Spezifität. Hier präsentieren wir einen markierungsfreien, nanoplasmonischen Biosensor-basierten Multiplex-Screening-Test für COVID-19, der 10 verschiedene Biomarker (6 virale Nukleinsäuregene, 2 Spike-Protein-Untereinheiten und 2 Antikörper) mit einer Nachweisgrenze im aM-Bereich, alles innerhalb einer Biosensor-Plattform.

Unsere neu entwickelten nanoplasmonischen Biosensoren weisen eine hohe Spezifität auf, die von größter Bedeutung ist, um Fehlreaktionen zu vermeiden. Als Machbarkeitsnachweis zeigen wir, dass unser Nachweisansatz das Potenzial hat, sowohl IgG- als auch IgM- Antikörper direkt aus COVID-19-positiven Patientenplasmaproben in einem einzigen Gerätelauf zu quantifizieren , was die Hochdurchsatzfähigkeit unseres Nachweisansatzes demonstriert. Am wichtigsten ist, dass unser Assay Empfangsbetriebsmerkmale, Bereiche unter der Kurve von 0,997 und 0,999 für IgG bzw. IgM, liefert. Der berechnete  p- Wert, der durch den nichtparametrischen Mann-Whitney-Test bestimmt wurde, beträgt für beide Antikörper <0,0001, wenn der Test von COVID-19-positiven Patienten ( n = 80) wird mit dem von Gesunden ( n  = 72) verglichen .

Darüber hinaus liefert der Screening-Test eine berechnete Sensitivität (richtig positive Rate) von 100 % (80/80), eine Spezifität (wahr negative Rate) > 96 % (77/80) , einen positiven Vorhersagewert von 98 % bei 5 % Prävalenz 5% , und ein negativer Vorhersagewert von 100 % bei einer Prävalenz von 5 %. Wir glauben, dass unser sehr sensibler Multiplex-Hochdurchsatz- Testansatz potenzielle Anwendungen in der COVID-19-Diagnostik hat , insbesondere bei der Bestimmung des Virusfortschritts und der Infektionsschwere für Kliniker für eine geeignete Behandlung, und sich auch als sehr effektiver diagnostischer Test erweisen wird Anwendung auf Krankheiten jenseits der COVID-19-Pandemie.

Genauigkeit alternierender nichtpolarisierbarer Kraftfelder zur Bestimmung von  Protein- Ligand-Bindungsaffinitäten, die von Kationen-π-Wechselwirkungen dominiert werden

Ändern Paar spezifische Lennard-Jones – Parameter durch das ungebundene FIX (NBFIX) Merkmal des CHARMM36 Kraftfeldes hat zur Verbesserung der Beschreibung von Kationen-π – Wechselwirkungen in biologischen Objekten mittels paarweise additiver potentieller Energie Funktionen kostengünstig erwiesen. Hier werden zwei Sätze neu optimierter CHARMM36-Kraftfeldparameter einschließlich NBFIX-Korrekturen, geprägt CHARMM36m-NBF und CHARMM36-WYF, und die ursprünglichen Kraftfelder, nämlich CHARMM36m und Amber ff14SB, verwendet, um die freien Standardbindungsenergien von sieben Protein- Ligandenkomplexe mit Kation-π-Wechselwirkungen.

Verglichen mit präzisen experimentellen Messungen zeigen unsere Ergebnisse, dass die unkorrigierten, ursprünglichen Kraftfelder die freien Bindungsenergien mit einem mittleren Fehler von 5,3 kcal/mol deutlich unterschätzen, während die mittleren Fehler von CHARMM36m-NBF und CHARMM36-WYF 0,8 und 2,1 . betragen kcal/mol bzw. Die vorliegende Studie zeigt überzeugend, dass die Verwendung modifizierter Parameter zusammen mit NBFIX-Korrekturen die Genauigkeit der freien Standardbindungsenergie von Protein-Ligand-Komplexen, die von Kation-π-Wechselwirkungen dominiert werden, dramatisch erhöht, insbesondere mit CHARMM36m-NBF.

Mit Hilfe zeitaufgelöster  Protein -induzierten Fluoreszenzverstärkung zu identifizieren stabilen lokalen Konformationen Ein α-Synuclein Monomer in einer Zeit

Die Verwendung spektroskopischer Lineale zur Verfolgung mehrerer Konformationen einzelner Biomoleküle und ihrer Dynamik hat das Verständnis der Strukturdynamik und ihrer Beiträge zur Biologie revolutioniert. Während das FRET-basierte Lineal über Abstände zwischen Farbstoffen im Bereich von 3-10 nm berichtet, berichten andere spektroskopische Techniken, wie die proteininduzierte Fluoreszenzverstärkung (PIFE), über die Nähe zwischen einem Farbstoff und einer Proteinoberfläche im kürzeren 0 .-Bereich -3 nm-Bereich. Unabhängig von der gewählten Methode werden bei der Messung frei diffundierender Biomoleküle nacheinander Histogramme der experimentellen Parameter abgerufen, die separate zentral verteilte Subpopulationen von Biomolekülen ergeben, wobei jede Subpopulationentweder eine einzelne Konformation, die innerhalb von Millisekunden unverändert blieb, oder mehrere Konformationen, die sich viel schneller als Millisekunden ineinander umwandeln, und somit eine gemittelte Unterpopulation.

Bei Einzelmolekül-FRET, bei dem der berichtete Parameter in den Histogrammen die Inter-Farbstoff-FRET-Effizienz ist, wurde zuvor berichtet, dass ein intrinsisch ungeordnetes Protein, wie das α-Synuclein-Monomer in Puffer, eine einzelne gemittelte Subpopulation von multiplen Konformationen, die sich schnell ineinander umwandeln. Während diese Ergebnisse der Vergangenheit vom 3-10-nm-Bereich des FRET-basierten Lineals abhängen, versuchten wir, dieses Protein mit Einzelmolekül-PIFE auf die Probe zu stellen, wobei wir die Fluoreszenzlebensdauer von ortsspezifischem sCy3-markiertem α-Synuclein . verfolgen Proteine ​​nacheinander. Interessanterweise weist sCy3-markiertes α-Synuclein bei Verwendung dieses spektroskopischen Näherungssensors mit kürzerer Reichweite mehrere Subpopulationen mit deutlich unterschiedlicher mittlerer Lebensdauer auf, die sich in 10-100 ms ineinander umwandeln.Diese Ergebnisse zeigen, dass α-Synuclein zwar global ungeordnet sein könnte, aber dennoch stabile lokale Strukturen erreicht. Zusammenfassend heben wir in dieser Arbeit den Vorteil der Verwendung verschiedener spektroskopischer Näherungssensoren hervor, die lokale oder globale Strukturänderungen pro Biomolekül verfolgen.

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