Proteinantwort  in adulten humanen primären Astrozyten als Reaktion auf wiederkehrende niedrige Glukose

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Abgeschwächte Induktion der ungefalteten  Proteinantwort  in adulten humanen primären Astrozyten als Reaktion auf wiederkehrende niedrige Glukose

Ziele/Hypothese:  Rezidivierende Hypoglykämien (RH) sind eine wesentliche Nebenwirkung einer intensiven Insulintherapie bei Menschen mit Diabetes. Veränderungen der Hypoglykämiewahrnehmung durch das Gehirn tragen zur Entwicklung einer beeinträchtigten gegenregulatorischen Reaktion auf und zur Wahrnehmung einer Hypoglykämie bei. Über die intrinsischen Veränderungen menschlicher Astrozyten als Reaktion auf akute und wiederkehrende niedrige Glukose (RLG)-Exposition ist wenig bekannt.

Methoden:  Humane primäre Astrozyten (HPA) wurden vier Tage lang drei Stunden pro Tag null , ein, drei oder vier Anfälle von niedrigem Glukosespiegel (0,1 mmol/l) ausgesetzt, um die relative Luftfeuchtigkeit nachzuahmen. Am vierten Tag wurden DNA und RNA gesammelt. Differentielle Genexpressions- und Ontologieanalysen wurden mit DESeq2 bzw. GOseq durchgeführt. Die DNA-Methylierung wurde mit der Infinium MethylationEPIC BeadChip-Plattform bewertet .

Ergebnisse: Es wurden  24 differentiell exprimierte Gene (DEGs) nachgewiesen (nach Korrektur für multiple Vergleiche). Ein Anfall einer niedrigen Glukoseexposition hatte den größten Effekt auf die Genexpression. Pathway-Analysen zeigten, dass Stress-bezogene Gene des Endoplasmatischen Retikulums (ER) wie  HSPA5 ,  XBP1 und  MANF , die an der ungefalteten Proteinantwort (UPR) beteiligt sind, nach einer niedrigen Glukose-(LG) -Exposition signifikant erhöht waren, die nach RLG verringert wurde . Es gab eine geringe Korrelation zwischen unterschiedlich methylierten Positionen und Veränderungen in der Genexpression, doch die Anzahl der LG-Expositionsschübe erzeugte deutliche Methylierungssignaturen.

Schlussfolgerungen/Interpretation:  Diese Daten legen nahe, dass die Exposition menschlicher Astrozyten gegenüber transientem LG die Aktivierung von Genen auslöst, die an der UPR beteiligt sind, die mit Stress des endoplasmatischen Retikulums (ER) verbunden ist. Nach RLG war die Aktivierung von UPR-verwandten Genen vermindert, was auf einen abgeschwächten ER-Stress hindeutet. Dies kann eine Folge einer erfolgreichen metabolischen Anpassung sein, wie zuvor berichtet , die das intrazelluläre Energieniveau besser bewahrt und eine geringere Notwendigkeit für die UPR.

Click-Chemie für die Bildgebung der  in-situ-  Proteinpalmitoylierung  während der asexuellen Stadien von  Plasmodium falciparum

Palmitoylierung bezieht sich auf die Modifikation der Cysteinthiole in Proteinen durch Fettsäuren, am häufigsten Palmitinsäure, durch Bildung einer „Thioesterbindung“. In vivo wird die Palmitoylierung von Proteinen durch Palmitoylacyltransferasen (PATs oder DHHC-PATs) katalysiert . Palmitoylierung hat sich kürzlich als entscheidende posttranslationale Modifikation bei Malariaparasiten herausgestellt. Die Expression und Aktivität von Palmitoyltransferasen variiert über verschiedene Entwicklungsstadien des Lebenszyklus des Malariaparasiten. Die Häufigkeit palmitoylierter Proteine ​​in einem gegebenen Stadium ist ein Maß für die PAT-Gesamtaktivität. Die PAT- Aktivität kann sich auch als Reaktion auf externe Signale oder Inhibitoren ändern.

Hier beschreiben wir ein Protokoll, um die Palmitoyl-Transferase-Aktivität während der asexuellen Stadien mit Click-Chemie und Fluoreszenzmikroskopie abzubilden. Diese Methode basiert auf der metabolischen Markierung eines klickbaren Analogs der Palmitinsäure durch parasitäre Zellen, gefolgt von CuAAC (Kupfer-katalysierte Alkin-Azid-Cycloadditionsreaktion) Click Chemistry, um palmitoylierte Proteine ​​fluoreszierend zu machen. Fluoreszenz ermöglicht die Quantifizierung der intrazellulären Palmitoylierung in Parasitenzellen über verschiedene Entwicklungsstadien hinweg. Mit dieser Methode beobachteten wir, dass die intrazelluläre Palmitoylierung zunimmt, wenn der Parasit vom Ring- zum Schizontenstadium übergeht und während der Schizontenstadien in Plasmodium falciparum am häufigsten vorkommt  .

Immun Subtraktion für eine verbesserte Auflösung in Serumprotein  Immunfixationselektrophorese und Antikörper – Isotyp – Bestimmung in einem Patienten mit Autoantikörpern

Isotypen der schweren Kette von monoklonalen Immunglobulinen mit niedrigem Spiegel werden manchmal bei der Serum-Immunfixationselektrophorese (SIFE) durch einen starken Hintergrund polyklonaler Immunglobuline verdeckt . Die genaue Bestimmung des Isotyps der schweren Kette ist jedoch für eine vollständige Diagnose unerlässlich, da die Isotypbestimmung von Autoantikörpern für die Bestimmung therapeutischer Verfahren von Bedeutung sein kann. Immunsubtraktion (IS) wurde bei einem Patienten mit Neuropathie und GD1a-Autoantikörper eingesetzt. IS erlaubte die Identifizierung der verwandten schweren Kette im Zusammenhang mit einer Lambda-Leichtketten- Restriktion, die auf dem anfänglichen SIFE vermerkt war, sowie die Isotypbestimmung des Autoantikörpers.

Antiseren, die für einzelne schwere und leichte Ketten spezifisch sind, wurden zur Depletion spezifischer Immunglobulintypen verwendet. Die Verarmung an mit der leichten Kappa-Kette assoziierten Immunglobulinen ermöglichte die eindeutige Bestimmung des Isotyps der mit der leichten Kette von Lambda assoziierten monoklonalen Bande mit niedrigem Niveau als IgG-Lambda. Eine selektive Abreicherung von Kappa-, Lambda-, Gamma- und mu-Schwerketten- Immunglobulinen wurde verwendet, um den IgG-Kappa-Isotyp des Autoantikörpers zu bestimmen.

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Frostschutz  – Protein –  Supplementierung während der Erwärmung von Vitrified Bovine Eierstockgewebe kann das Eierstockgewebe Qualität Nach Xenotransplantation verbessern

 

Das Auftreten von Eiskristallisation während der Kryokonservierung von Eierstockgewebe (OT) verursacht unvermeidbare Kryoschäden, und eine Eisrekristallisation während der Erwärmung ist nachteiliger als eine Eiskristallisation. Hier untersuchten wir, dass die Behandlung mit Frostschutzprotein (AFP) während des Erwärmungsverfahrens die Qualität der Rinder-OT nach Xenotransplantation (XT) verbessern kann. Rinder-OTs (n=120) wurden gleichmäßig vier Gruppen zugeordnet: frisch, vitrifiziert-erwärmt, vitrifiziert-erwärmt mit 10 mg/ml Leucosporidium-Eisbindungsprotein (LeIBP, eine Art von AFP) (LeIBP-10) und vitrifiziert- erwärmt mit 20 mg/mL LeIBP (LeiBP-20). LeIBPs wurden der ersten Erwärmungslösung zugesetzt. Jeder Kategorie wurden 20 Stück OTs zugeordnet. Die verbleibenden 10 OTs aus jeder Kategorie wurden der XT-Fresh-Kontrolle, der XT-Vitrified-warmed-Kontrolle, der XT-LeIBP-10- bzw. XT-LeIBP-20-Gruppe zugeordnet und in 9 Wochen alte ovariektomierte Nacktmäuse xenotransplantiert für eine Woche.

Die LeIBP-Behandlung während des Erwärmungsschritts erhöhte die morphologische Follikelnormalität und verringerte die apoptotischen Follikelverhältnisse nach Vitrifikations-Erwärmung und XT . Die XT-vitrifiziert-gewärmte Kontrollgruppe zeigte im Vergleich zur XT-frischen Gruppe eine signifikant reduzierte Mikrogefäßdichte und eine erhöhte Fibrose. Mikrogefäßdichte und Fibrose wurden in beiden mit LeIBP behandelten Gruppen wiedergefunden. Bei allen Endpunkten gab es keinen signifikanten Unterschied zwischen den LeIBP-10- und LeIBP-20-Gruppen. Die AFP-Behandlung während des Erwärmungsverfahrens kann OT-Schäden verhindern und die Morphologie und Apoptose der Ovarialfollikel sowohl in der vitrifizierten erwärmten Rinder-OT als auch in ihrem Transplantat verbessern . Nach Bestätigung in einer Humanstudie können AFPs potenziell auf humane OT . angewendet werden Kryokonservierung, um Kryoschäden zu reduzieren und die OT-Qualität zu verbessern.

 

Doxorubicin/Nucleophosmin-bindendes  Protein -konjugierte Nanopartikel verstärken die Anti-Leukämie-Aktivität in akuten lymphoblastischen Leukämiezellen  in vitro  und  in vivo

Die akute lymphatische Leukämie (ALL) ist eine aggressive bösartige Erkrankung. Erwachsene mit ALL haben eine Rückfallrate von mehr als 50 %. Wir haben zuvor validiert, dass die Überexpression von Nukleophosmin (NPM) an der Entwicklung von Multidrug- Resistenz (MDR) während ALL beteiligt ist ; und ein synthetisch hergestelltes rekombinantes NPM-bindendes Protein (NPMBP) wurde in unserer Gruppe entwickelt; NPMBP und Doxorubicin (DOX) können in einem auf Nanopartikeln basierenden Wirkstoffabgabesystem namens DOX-PMs-NPMBP konjugiert werden, um MDR bei ALL entgegenzuwirken. Hier haben wir das Antileukämiepotential von DOX-PMs-NPMBP in resistenten ALL-Zellen untersucht. Diese Studie zeigt, dass DOX-PMs-NPMBP die Chemosensitivität gegenüber DOX in ALL-Zellen signifikant erhöht.

Trotz unterschiedlicher Konzentrationen waren sowohl resistente als auch primäre ALL-Zellen von rezidivierten Patienten empfindlich gegenüber DOX-PMs-NPMBP . Im Detail lagen die Werte der halbmaximalen Hemmkonzentration (IC50) von DOX-PMs-NPMBP zwischen 1,6- und 7,0-fach niedriger als die von DOX in Zelllinien bzw. primären ALL-Zellen; und das Verhältnis der apoptotischen Zellen war bei DOX-PMs-NPMBP mehr als 2-fach höher als bei DOX. Mechanistisch spielten die p53-getriebene Apoptose-Induktion und der Zellzyklus-Arrest eine wesentliche Rolle bei den DOX-PMs-NPMBP-induzierten Anti-Leukämie-Effekten. Darüber hinaus hemmte DOX-PMs-NPMBP signifikant das Tumorwachstum und verlängerte das Überleben von Mäusen von ALL-Xenotransplantatmodellen; und keine systemischeDas Auftreten von Toxizität wurde nach der Behandlung während der Nachbeobachtung beobachtet. Zusammenfassend zeigen diese Daten, dass DOX-PMs-NPMBP eine signifikante Wachstumshemmung und Apoptose-Induktion ausüben und die DOX-Antileukämie-Aktivität in resistenten ALL-Zellen deutlich verbessern kann. Dieses neuartige Wirkstoffabgabesystem könnte für die Entwicklung als neue therapeutische Strategie gegen multiresistente ALL wertvoll sein.

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